ここでは浮遊細胞のストック作製を記載していきます。

必要な培地、試薬

• 培地(RPMI-1640 + 10%FBS + 1%P/Sもしくは、RPMI-1640 + 10%FBS + 1%P/S + G-CSF, 「培地の調製」で調製したもの)
• 70%エタノール
• 細胞凍結保存液
• トリパンブルー溶液

必要な機器

• ウォーターバス
• クリーンベンチ
• ピペットマン(P-1000、P-20もしくはP-10)
• チップ(1 mL、200 µL)
• 遠沈管(15 mL)
• 培地吸引機
• 遠心分離機
• 1.5 mLチューブ
• 血球計算盤またはセルカウンター
• ピペッター(電動を推奨)
• ピペット(10 mL用)
• クライオチューブ
• 油性ペン
• 倒立顕微鏡
• -80℃ディープフリーザー
• 液体窒素タンク

 プロトコル

1. インキュベータからフラスコを取り出し、倒立顕微鏡で細胞の状態を確認し、インキュベータに戻す。
2. ウォーターバスを37℃に設定し、培地を30分程度温め、70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれておく。
3. フラスコを70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれる。
4. フラスコから全量、15 mL遠沈管に回収する。
5. 遠心分離(200 x g, 5分もしくは1500 rpm, 3分)
6. 遠心後、沈殿を確認し、上清を捨てる。
7. 2 mLの培地を添加し、ピペッティングで細胞懸濁液を作る。
8. 10 µLの13.で作成した細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、10 µLのトリパンブルー染色液と混和する。
9. 血球計算盤、もしくはセルカウンターで細胞数をカウントする。
10. クライオチューブに油性ペンで「日付、継代数、細胞名」を記載する。
11. 生細胞数1 x 10⁶ cellsに対して、凍結保存液を1 mL加え、ピペッティングで混和する。
12. クライオチューブに1 mLずつ分注する。
13. -80℃ディープフリーザーで凍結保存する。
14. (オプション)必要に応じて液体窒素タンクで保存する。

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ここでは浮遊細胞の培地交換を記載していきます。

必要な培地、試薬

• 培地(RPMI-1640 + 10%FBS + 1%P/Sもしくは、RPMI-1640 + 10%FBS + 1%P/S + G-CSF, 「培地の調製」で調製したもの)
• 70%エタノール
• トリパンブルー溶液

必要な機器

• ウォーターバス
• クリーンベンチ
• ピペットマン(P-1000)
• チップ(1 mL)
• 遠沈管(15 mL)
• 培地吸引機
• 遠心分離機
• 1.5 mLチューブ
• 血球計算盤またはセルカウンター
• ピペッター(電動を推奨)
• ピペット(10 mL用)
• T75フラスコ
• 油性ペン
• 倒立顕微鏡
• インキュベータ

 プロトコル

1. インキュベータからフラスコを取り出し、倒立顕微鏡で細胞の状態を確認する。
2. ウォーターバスを37℃に設定し、培地を30分程度温め、70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれておく。
3. フラスコを70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれる。
4. T75フラスコから培地を全量、15 mL遠沈管に移す。
5. 遠心分離(200 x g, 5分もしくは1500 rpm, 3分)
6. 遠心後、沈殿を確認し、上清を捨てる。
7. 2 mLの培地を添加し、ピペッティングで細胞懸濁液を作る。
8. 全量をT75フラスコに添加し、培地を8 mL継代する。
9. フラスコの上面に油性ペンで「日付、継代数、名前、細胞名」を記載する。
10. 倒立顕微鏡で細胞を確認する。
11. インキュベータにフラスコを移して培養する。
12. 翌日、細胞を確認する。

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ここでは浮遊細胞の継代方法を記載していきます。

必要な培地、試薬

• 培地(RPMI-1640 + 10%FBS + 1%P/Sもしくは、RPMI-1640 + 10%FBS + 1%P/S + G-CSF, 「培地の調製」で調製したもの)
• 70%エタノール
• トリパンブルー溶液

必要な機器

• ウォーターバス
• クリーンベンチ
• ピペットマン(P-1000、P-20もしくはP-10)
• チップ(1 mL、200 µL)
• 遠沈管(15 mL)
• 培地吸引機
• 遠心分離機
• 1.5 mLチューブ
• 血球計算盤またはセルカウンター
• ピペッター(電動を推奨)
• ピペット(10 mL用)
• T75フラスコ
• 油性ペン
• 倒立顕微鏡
• インキュベータ

 プロトコル

1. インキュベータからフラスコを取り出し、倒立顕微鏡で細胞の状態を確認し、インキュベータに戻す。80%コンフルエントに達していない場合は培地交換を行う。
2. ウォーターバスを37℃に設定し、培地を30分程度温め、70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれておく。
3. フラスコを70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれる。
4. T75フラスコから培地を全量、15 mL遠沈管に移す。
5. 遠心分離(200 x g, 5分もしくは1500 rpm, 3分)
6. 遠心後、沈殿を確認し、上清を捨てる。
7. 2 mLの培地を添加し、ピペッティングで細胞懸濁液を作る。
8. 10 µLの13.で作成した細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、10 µLのトリパンブルー染色液と混和する。
9. 血球計算盤、もしくはセルカウンターで細胞数をカウントする。
10. T75フラスコへ継代する場合、生細胞数が1 x 10⁶ cellsになるように13.の細胞懸濁液をフラスコに添加し、培地を全容量が10 mLになるように添加する。
11. フラスコの上面に油性ペンで「日付、継代数(ここではP=1)、名前、細胞名」を記載する。
12. 倒立顕微鏡で細胞を確認する。
13. インキュベータにフラスコを移して培養する。
14. 翌日、細胞を確認する。

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ここでは浮遊細胞ストックの融解方法を記載していきます。

必要な培地、試薬

• 培地(RPMI-1640 + 10%FBS + 1%P/Sもしくは、RPMI-1640 + 10%FBS + 1%P/S + G-CSF, 「培地の調製」で調製したもの)
• 70%エタノール
• トリパンブルー溶液

必要な機器

• ウォーターバス
• クリーンベンチ
• ピペットマン(P-1000、P-20もしくはP-10)
• チップ(1 mL、200 µL)
• 遠沈管(15 mL)
• 遠心分離機
• 培地吸引機
• 1.5 mLチューブ
• 血球計算盤またはセルカウンター
• ピペッター(電動を推奨)
• ピペット(10 mL用)
• T75フラスコ
• 油性ペン
• 倒立顕微鏡
• インキュベータ

プロトコル

1. ウォーターバスを37℃に設定し、培地を温めて、クリーンベンチ内にいれておく。
2. 液体窒素、-80℃冷凍庫から細胞ストックを持ってくる。
3. ストック容器を持ちながらすぐに1.で37℃に設定したウォーターバスで1分間温める。

   ポイント

   少し氷が解け残っている状態で取り出す。

4. 70%エタノールでストック容器を拭き、クリーンベンチ内に入れる。

5. ストック容器を開け、1.で温めておいた1 mLの培地を上からかけて混和する。

   ポイント

   1 mL入らない場合は、できる限り加える。

6. 15 mLの遠沈管に全量移す。
7. 培地を1 mL取り、細胞が入っていたストック容器に添加し、壁に残った液を回収し、6.の遠沈管に上から添加する。
8. もう一度、培地を1 mL取り、細胞が入っていたストック容器に添加し、壁に残った液を回収し、6.の遠沈管に上から添加する。
9. 細胞を回収した7.の遠沈管に培地を更に加え、5 mLにメスアップする。
10. 遠心分離(200 x g, 5分もしくは1500 rpm, 3分)
11. 遠心後、沈殿を確認し、上清を捨てる。
12. 1 mLの培地を添加し、ピペッティングで細胞懸濁液を作る。
13. 10 µLの10.で作成した細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、10 µLのトリパンブルー染色液と混和する。
14. 血球計算盤、もしくはセルカウンターで細胞数をカウントする。
15. 10.で作成した細胞懸濁液をT75 フラスコに入れ、10 mLの培地を上から加える。
16. フラスコの上面に油性ペンで「日付、継代数(ここではP=1)、名前、細胞名」を記載する。
17. 倒立顕微鏡で細胞を確認する。
18. インキュベータにフラスコを移して培養する。
19. 翌日、細胞を確認する。

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ここでは浮遊細胞の培養に必要な培地の調製法を記載していきます。

必要な培地、試薬

• RPMI-1640(容量500mL)
• ウシ胎児血清 (FBS: Fetal bovine serum)
• ペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)
• 70%エタノール
• G-CSF (NFS-60、TF-1細胞を培養する場合)

必要な機器

• クリーンベンチ
• ウォーターバス
• ピペット(50 mL用, 5mL用)
• ピペッター(電動を推奨)
• 油性ペン
• セロハンテープ

プロトコル

1. ウシ胎児血清とP/Sを融解する。(冷蔵庫で一晩もしくは室温)
2. ウシ血清は50 mLずつ遠沈管に、P/Sは5 mLずつに遠沈管に分注し、使わないものは-20℃の冷凍庫で保管する。
3. 56℃のウォータバスでウシ胎児血清を30分間処理する。(血清の非働化)
   

   注意ポイント

   非働化は30分以上行わない。一度非働化を行った血清を使用する際は、この操作は不要です。
4. RPMI-1640培地、非働化したFBS、P/Sの容器を70%エタノールで消毒し、クリーンベンチ内に入れる。
5. RPMI-1640培地の容器の中に全量(50 mL)のFBSと5mLのP/Sを入れる。
6. (NFS-60細胞の場合:終濃度2 ng/mLとなるようにG-CSFを添加する。TF-1細胞の場合:終濃度62 ng/mLとなるようにG-CSFを添加する。)
7. 培地のラベルに油性ペンで「調製した日付」と「10%FBS + 1%P/S」(NSF-60及びTF-1細胞の場合:「10%FBS + 1%P/S + G-CSF」)を記載し、記載した所にセロハンテープを貼る。
8. 培地は2~4℃の冷蔵庫で保存する。

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ここでは接着細胞の細胞ストック作製法を記載していきます。

必要な試薬

• 培地(DMEM + 10%FBS + 1%P/S, 「培地の調製」で調製したもの)
• D-PBS(-)(細胞培養グレードの市販品を推奨)
• トリプシン-EDTA
• 細胞凍結保存液
• 70%エタノール
• トリパンブルー溶液

必要な機器

• ウォーターバス
• クリーンベンチ
• ピペットマン(P-1000、P-20もしくはP-10)
• チップ(1 mL、200 µL)
• 遠沈管(15 mL)
• 培地吸引機
• 遠心分離機
• 1.5 mLチューブ
• 血球計算盤またはセルカウンター
• ピペッター(電動を推奨)
• ピペット(10 mL用)
• クライオチューブ
• 油性ペン
• 倒立顕微鏡
• -80℃ディープフリーザー
• 液体窒素タンク

 プロトコル

1. インキュベータからdishを取り出し、倒立顕微鏡で細胞の状態を確認し、インキュベータに戻す。
2. ウォーターバスを37℃に設定し、培地及びD-PBS(-)を30分程度温め、70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれておく。
3. dishを70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれる。
4. 培養してきた培地をdishから全量、吸引除去後、1.で温めたD-PBS(-)を10 mLとり、dishに添加する。
5. 添加後、D-PBS(-)をdishから全量、吸引除去する。
6. 1 mLトリプシン-EDTAをdishに加えて、dishを揺らして、均一に液を行き渡らせる。
7. インキュベータに入れて3分間インキュベートする。
   

   注意ポイント

   3分以上インキュベートしないで下さい。
8. インキュベート後、dishを揺らして細胞が剥がれている事を確認する。

   ポイント

   あまり剥がれていない場合、dishを強く左右に揺すって下さい。もしくはピペットマンでdish中のトリプシン-EDTAを吸い、剥がれていない所にかけて下さい。
9. 確認後、すぐに10 mLの培地をdishに添加する。
10. 添加後、全量を15 mLの遠沈管に移す。
11. 遠心分離(200 x g, 5分もしくは1500 rpm, 3分)
12. 遠心後、沈殿を確認し、上清を捨てる。
13. 2 mLの培地を添加し、ピペッティングで細胞懸濁液を作る。
14. 10 µLの13.で作成した細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、10 µLのトリパンブルー染色液と混和する。
15. 血球計算盤、もしくはセルカウンターで細胞数をカウントする。
16. クライオチューブに油性ペンで「日付、継代数、細胞名」を記載する
17. 生細胞数1 x 10⁶ cellsに対して、凍結保存液を1 mL加え、ピペッティングで混和する。
18. クライオチューブに1 mLずつ分注する。
19. -80℃ディープフリーザーで凍結保存する。
20. (オプション)必要に応じて液体窒素タンクで保存する。

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ここでは浮遊細胞の一般的な培養方法を紹介します。

このプロトコルで下記の細胞の培養経験があります。

THP-1、NFS-60、TF-1

必要な所を参考にしていただければ幸いです。

step
1浮遊細胞用の培地調製

step
2浮遊細胞ストックの融解

step
3浮遊細胞の培地交換

step
4浮遊細胞の継代

step
5浮遊細胞の細胞ストック作製

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ここでは接着細胞の培地交換を記載していきます。

必要な培地、試薬

• 培地(DMEM + 10%FBS + 1%P/S, 「培地の調製」で調製したもの)
• D-PBS(-)(細胞培養グレードの市販品を推奨)

必要な機器

• ウォーターバス
• クリーンベンチ
• ピペッター(電動を推奨)
• ピペット(10 mL用)
• 培地吸引機
• 倒立顕微鏡
• インキュベータ

 プロトコル

1. インキュベータからdishを取り出し、倒立顕微鏡で細胞の状態を確認し、インキュベータに戻す。
2. ウォーターバスを37℃に設定し、培地及びD-PBS(-)を30分程度温め、70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれておく。
3. dishを70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれる。
4. 培養してきた培地をdishから全量、吸引除去後、1.で温めたD-PBS(-)を10 mLとり、dishに添加する。
5. 添加後、D-PBS(-)をdishから全量、吸引除去する。
6. 1.で温めたD-PBS(-)を10 mLとり、dishに添加する。
7. 倒立顕微鏡で細胞を確認する。

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ここでは接着細胞の継代方法を記載していきます。

必要な培地、試薬

• 培地(DMEM + 10%FBS + 1%P/S, 「培地の調製」で調製したもの)
• D-PBS(-)(細胞培養グレードの市販品を推奨)
• トリプシン-EDTA
• 70%エタノール
• トリパンブルー溶液

必要な機器

• ウォーターバス
• クリーンベンチ
• ピペットマン(P-1000、P-20もしくはP-10)
• チップ(1 mL、200 µL)
• 遠沈管(15 mL)
• 培地吸引機
• 遠心分離機
• 1.5 mLチューブ
• 血球計算盤またはセルカウンター
• ピペッター(電動を推奨)
• ピペット(10 mL用)
• 10 cm dish
• 油性ペン
• 倒立顕微鏡
• インキュベータ

 プロトコル

1. インキュベータからdishを取り出し、倒立顕微鏡で細胞の状態を確認し、インキュベータに戻す。80%コンフルエントに達していない場合は培地交換を行う。
2. ウォーターバスを37℃に設定し、培地及びD-PBS(-)を30分程度温め、70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれておく。
3. dishを70%エタノールで消毒後、クリーンベンチ内にいれる。
4. 培養してきた培地をdishから全量、吸引除去後、1.で温めたD-PBS(-)を10 mLとり、dishに添加する。
5. 添加後、D-PBS(-)をdishから全量、吸引除去する。
6. 1 mLトリプシン-EDTAをdishに加えて、dishを揺らして、均一に液を行き渡らせる。
7. インキュベータに入れて3分間インキュベートする。
   

   注意ポイント

   3分以上インキュベートしないで下さい。
8. インキュベート後、dishを揺らして細胞が剥がれている事を確認する。

   ポイント

   あまり剥がれていない場合、dishを強く左右に揺すって下さい。もしくはピペットマンでdish中のトリプシン-EDTAを吸い、剥がれていない所にかけて下さい。
9. 確認後、すぐに10 mLの培地をdishに添加する。
10. 添加後、全量を15 mLの遠沈管に移す。
11. 遠心分離(200 x g, 5分もしくは1500 rpm, 3分)
12. 遠心後、沈殿を確認し、上清を捨てる。
13. 2 mLの培地を添加し、ピペッティングで細胞懸濁液を作る。
14. 10 µLの13.で作成した細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、10 µLのトリパンブルー染色液と混和する。
15. 血球計算盤、もしくはセルカウンターで細胞数をカウントする。
16. 10 cm dish に継代する場合、生細胞数が1 x 10⁶ cellsになるように13.の細胞懸濁液をdishに添加し、培地を全容量が10 mLになるように添加する。
17. dishの蓋に油性ペンで「日付、継代数(ここではP=1)、名前、細胞名」を記載する。
18. 倒立顕微鏡で細胞を確認する。
19. インキュベータにdishを移して培養する。
20. 翌日、接着しているかを確認する。

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ここでは接着細胞ストックの融解方法を記載していきます。

必要な培地、試薬

• 培地(DMEM + 10%FBS + 1%P/S, 「培地の調製」で調製したもの)
• 70%エタノール
• トリパンブルー溶液

必要な機器

• ウォーターバス
• クリーンベンチ
• ピペットマン(P-1000、P-20もしくはP-10)
• チップ(1 mL、200 µL)
• 遠沈管(15 mL)
• 遠心分離機
• 培地吸引機
• 1.5 mLチューブ
• 血球計算盤またはセルカウンター
• ピペッター(電動を推奨)
• ピペット(10 mL用)
• 10 cm dish
• 油性ペン
• 倒立顕微鏡
• インキュベータ

プロトコル

1. ウォーターバスを37℃に設定し、培地を温めて、クリーンベンチ内にいれておく。
2. 液体窒素、-80℃冷凍庫から細胞ストックを持ってくる。
3. ストック容器を持ちながらすぐに1.で37℃に設定したウォーターバスで1分間温める。

   ポイント

   少し氷が解け残っている状態で取り出す。

4. 70%エタノールでストック容器を拭き、クリーンベンチ内に入れる。

5. ストック容器を開け、1.で温めておいた1 mLの培地を上からかけて混和する。

   ポイント

   1 mL入らない場合は、できる限り加える。

6. 15 mLの遠沈管に全量移す。
7. 培地を1 mL取り、細胞が入っていたストック容器に添加し、壁に残った液を回収し、6.の遠沈管に上から添加する。
8. もう一度、培地を1 mL取り、細胞が入っていたストック容器に添加し、壁に残った液を回収し、6.の遠沈管に上から添加する。
9. 細胞を回収した7.の遠沈管に培地を更に加え、5 mLにメスアップする。
10. 遠心分離(200 x g, 5分もしくは1500 rpm, 3分)
11. 遠心後、沈殿を確認し、上清を捨てる。
12. 1 mLの培地を添加し、ピペッティングで細胞懸濁液を作る。
13. 10 µLの10.で作成した細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、10 µLのトリパンブルー染色液と混和する。
14. 血球計算盤、もしくはセルカウンターで細胞数をカウントする。
15. 10.で作成した細胞懸濁液を10 cm dishに入れ、10 mLの培地を上から加える。
16. dishの蓋に油性ペンで「日付、継代数(ここではP=1)、名前、細胞名」を記載する。
17. 倒立顕微鏡で細胞を確認する。
18. インキュベータにdishを移して培養する。
19. 翌日、接着しているかを確認する。

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